прислала Veritas
История развития.В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики:
- доказательство А. Келером принципиальной возможности создания люминесцентного микроскопа;
- создание в 1911 г. Люминесцентного микроскопа, который был использован русским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток;
- применение сильно разбавленных растворов флюорохромов, избирательно связывающихся с определёнными структурами клеток [М. Хайтингер, 1933-1935], и прежде всего акридинового оранжевого [Хайтингер, Штруггер, 1940]
- разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки [Е.М. Брумберг и Г. Н. Крылова, 1953]
- выпуск отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе.
- создание метода иммунофлуоресценции, нашедшего широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико – биологических исследований. [А. Н. Кунс, 1942]
Люминесцентная микроскопия.
Люминесцентная микроскопия (лат. Lumen, luminis свет; греч. Micros малый + skopeo рассматривать, исследовать) – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.
Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обусловливает возможность использования л.м. в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1 , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами. Эта способность флюорохромов к избирательному окрашиванию позволяет проводить люминесцентно – цитологический и люминесцентно – цитохимический анализ.
Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биологическим микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак – иллюминатор имеет ряд преимуществ:
- интерференционная светоделительная пластинка с нанесёнными на неё слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции;
- объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещённость препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвёртой степени апертуры объектива;
- люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа.
Источниками освещения для люминесцентного микроскопа чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также лампы накаливания: ксеноновые и кварцево-галогенные.
Для возбуждения люминесценции при люминесцентной микроскопии обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зелёную область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычно стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям. В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт).
Люминесцентные микроскопы серии «Люмам»
Исследовательский люминесцентный микроскоп «Люмам И-3»
Рабочий люминесцентный микроскоп «Люмам Р-1»Люминесцентная микроскопия органов и тканей.
Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патологической гистологии. Основными преимуществами Люминесцентной микроскопии являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим. методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию.
Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение. возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин В2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин В1 в щелочном растворе переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной кислоты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохимического количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.
Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами . Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитологических и гистологических препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда. Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы. как кофеин 5 и родамин. могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин ЗР применяют для определения липидов. С этой же целью используют раствор 3.4-бензпирена в насыщенном растворе кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью раствора раморина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов раствором солохрома черного удается выявить алюминий (жёлто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в лёгких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).
Список литературы:
- Большая медицинская энциклопедия, Москва, изд. «Советская энциклопедия», 1980. Т.13., гл. ред. Б.В. Петровский
- А.Н. Ремизов Медицинская и биологическая физика. Москва, изд. «Высшая школа», 1996.
- В.Ф. Антонов Биофизика Москва, изд. «Владос», 2000
